Azul de tiazolilo CAS 298-93-1

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Azul de tiazolilo, más conocido como MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), alberga una dualidad fascinante: es a la vez una herramienta vital en la biología celular y una rareza química camaleónica. Este polvo cristalino amarillo sufre una sorprendente metamorfosis en las células vivas: las reductasas mitocondriales escinden su anillo de tetrazolio, transformándolo en un precipitado insoluble de formazán de color púrpura, una reacción tan visualmente sorprendente que se ha convertido en el estándar de oro para medir la viabilidad celular. Sin embargo, más allá de la mesa de laboratorio, MTT revela comportamientos más esotéricos; su estructura cristalina forma patrones peculiares en forma de "espina de pescado" bajo microscopía, mientras que sus propiedades redox le permiten participar en reacciones fotoquímicas exóticas cuando se expone a longitudes de onda de luz específicas. Curiosamente, el compuesto exhibe un raro fenómeno llamado "metacromasia": aparece en diferentes colores según la concentración y el entorno molecular, una propiedad que alguna vez explotaron los químicos textiles para crear tintes "inteligentes". Estudios recientes han descubierto su inesperado papel como inhibidor débil de ciertas enzimas de la cadena respiratoria, lo que sugiere que este omnipresente reactivo de ensayo puede haber estado influyendo sutilmente en los procesos metabólicos que los científicos lo utilizan para estudiar. Cuando se disuelven en disolventes orgánicos, las soluciones de MTT muestran un efecto inusual de extinción de la fluorescencia que ha desconcertado a los físicos químicos, sugiriendo interacciones intermoleculares complejas que aún esperan una explicación completa.

Azul de tiazoliloEl nombre químico es bromuro de 3- (4,5-dimetil-2-tiazol) -2,5-difeniltetrazolio, abreviado como MTT, que es un compuesto orgánico importante. Desde que Mosman informó por primera vez sobre el uso de la tinción con MTT para determinar el crecimiento y la supervivencia celular en 1983, el MTT se ha aplicado ampliamente en campos como las ciencias biológicas, la investigación médica y el desarrollo de fármacos. A continuación se explica detalladamente su finalidad:

Aplicación en la investigación de biología celular

 

MTT es uno de los métodos clásicos para determinar la proliferación celular. Durante el cultivo celular, las deshidrogenasas como la succinato deshidrogenasa en las mitocondrias de células vivas pueden reducir el MTT exógeno a formazán cristalino azul púrpura insoluble, que se deposita en la célula. Las células muertas carecen de esta capacidad reductora y por tanto no producen formazán. Al disolver el formazán en las células y medir su valor de absorción de luz en longitudes de onda específicas (como 490 nm o 562 nm) utilizando un lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima-(ELISA), el número de células vivas se puede reflejar indirectamente. Dentro de un cierto rango de números de células, la cantidad de cristales de MTT formados es proporcional al número de células, por lo que la proliferación celular se puede determinar en función del valor de absorbancia medido (valor OD).

Aplicación en la investigación de biología celular

 

MTT también se puede utilizar para determinar la toxicidad de fármacos u otros métodos de tratamiento (como la irradiación) en células cultivadas in vitro. Comparando los valores de DO del grupo de tratamiento y del grupo de control, se puede evaluar el efecto de los fármacos o métodos de tratamiento sobre la actividad celular. Cuanto mayor sea el valor de OD, más fuerte será la actividad celular; Por el contrario, indica que cuanto más débil es la actividad celular o mayor es la toxicidad celular. Este método tiene amplias aplicaciones en la detección de drogas, la investigación toxicológica y otros campos. Aunque el MTT se utiliza principalmente para medir la proliferación celular y la citotoxicidad, en algunos casos también puede utilizarse para ayudar en el estudio de la apoptosis celular. Durante el proceso de apoptosis celular, la actividad enzimática dentro de la célula cambia, lo que puede afectar la capacidad reductora del MTT. Al comparar la diferencia en los valores de DO entre las células apoptóticas y las células normales, se puede determinar preliminarmente la aparición de apoptosis celular. Sin embargo, cabe señalar que MTT no es un método especializado para detectar la apoptosis celular y sus resultados deben analizarse exhaustivamente junto con otros métodos de detección de apoptosis.

Aplicación en el desarrollo de fármacos.

 

En el proceso de desarrollo de fármacos, el ensayo MTT es un método de detección de fármacos de alto rendimiento-que se utiliza habitualmente. Al incubar conjuntamente el fármaco de prueba con células y utilizar el ensayo MTT para medir los cambios en la actividad celular, se pueden detectar rápidamente posibles moléculas activas del fármaco. Este método tiene las ventajas de una operación fácil, resultados confiables y un alto rendimiento, y tiene un valor de aplicación importante en la etapa inicial del desarrollo de fármacos. El ensayo MTT también se puede utilizar para estudiar el mecanismo de acción de los fármacos. Al comparar los cambios en la actividad celular en diferentes condiciones de tratamiento farmacológico, se puede determinar de forma preliminar el impacto de los fármacos en procesos como la proliferación celular y la apoptosis. Combinando otras técnicas de biología molecular, como la transferencia Western y la citometría de flujo, se pueden revelar aún más los objetivos y las vías de señalización de los fármacos. En la evaluación de la seguridad de los medicamentos, el ensayo MTT se puede utilizar para evaluar los efectos tóxicos de los medicamentos en las células. Al medir los cambios en el valor de DO de las células después del tratamiento farmacológico, es posible determinar si el fármaco tiene citotoxicidad y la fuerza de la toxicidad. Esto es de gran importancia para guiar la investigación preclínica y la aplicación clínica de fármacos.

La aplicación del MTT en otros campos

 

En la investigación inmunológica, el ensayo MTT se puede utilizar para determinar la capacidad de proliferación de los linfocitos. Al incubar conjuntamente linfocitos con antígenos o inmunoestimulantes y medir los cambios en la actividad celular mediante el ensayo MTT, se puede evaluar la capacidad de respuesta inmune de los linfocitos. Este método tiene amplias aplicaciones en el desarrollo de vacunas, inmunoterapia y otros campos. En la investigación oncológica, el ensayo MTT se puede utilizar para determinar la actividad de proliferación y la sensibilidad a los fármacos de las células tumorales. Al comparar los cambios en los valores de DO de las células tumorales en diferentes condiciones de tratamiento farmacológico, se pueden detectar moléculas de fármacos con efectos inhibidores sobre las células tumorales y evaluar sus efectos antitumorales. Esto es de gran importancia para guiar el tratamiento clínico de los tumores. En la investigación de toxicología ambiental, el ensayo MTT se puede utilizar para evaluar los efectos tóxicos de los contaminantes ambientales en las células. Al coincubar células con diferentes concentraciones de contaminantes y medir los cambios en la actividad celular mediante el ensayo MTT, se puede determinar la toxicidad y el mecanismo de acción de los contaminantes. Esto es de gran importancia para evaluar los riesgos ecológicos de los contaminantes ambientales y formular políticas de protección ambiental. 

Pasos experimentales deazul de tiazolilométodo:

1: La tripsina digiere las células en fase logarítmica, las centrifuga y las recoge después de la terminación para preparar una suspensión celular y ajusta su concentración a 5-10 por recuento de células × 104/ml. Para los principiantes, es necesario hacer que las células alcancen 5-10 × 104/ml y muchas veces no se sabe por dónde empezar. Estoy aquí para brindarle un método simple para determinar inicialmente la cantidad de celdas.

Tomemos como ejemplo 25 cm2 que se utilizan habitualmente para el cultivo celular:

1) La densidad celular es aproximadamente del 80 % al 90 % (la siguiente figura muestra el estado aproximado de las células con una densidad del 80 % al 90 %). Después de la digestión y centrifugación, retire el sobrenadante y agregue 3 ml de medio para mezclarlo.

2) Tome un nuevo tubo de centrífuga estéril de 15 ml (para el siguiente paso de inoculación de una placa de 96 pocillos) y llénelo con aproximadamente 9 ml de medio.

3) Tome 1 ml de la suspensión celular de 3 ml preparada en el primer paso, agréguelo al tubo superior y cuente las células después de mezclar. En este momento, generalmente es de 5 a 10 o menos × 104/ml, lo que equivale a 5 a 10 células por celda en 4 celdas del tablero de conteo de células (consulte la figura a continuación); Si la concentración no es suficiente, se agregará la suspensión celular de acuerdo con el resultado del recuento y cada gota se calculará como 50 ul.

4) El número de células debe ajustarse según los diferentes propósitos del experimento. Por ejemplo, en un experimento de proliferación celular general, se pueden utilizar 2000 células por pocillo (equivalente a una densidad de suspensión celular de 2 x 104/ml), de 5000 a 10000 células por pocillo (equivalente a una densidad de suspensión celular de 5 x 104/ml). Además, el número de células también debe determinarse en función de sus propias características, como la velocidad de crecimiento. Por ejemplo, la densidad de células que crecen más rápido puede ser ligeramente menor.

2. Después de preparar la suspensión celular, mézclela suavemente y agregue 100 ul en cada orificio, de modo que la densidad de las células a analizar sea de 5000-10000/orificio (el orificio del borde se llena con PBS estéril).

L Nota: Debido a que las células continuarán sedimentándose después de la mezcla, es necesario mezclar repetidamente durante el proceso de inoculación, como mezclar una vez cada seis hoyos, para garantizar que la densidad celular de la inoculación sea exactamente la misma entre los hoyos, lo cual es crucial para los resultados de MTT.

3. Coloque la placa de cultivo celular inoculada en la incubadora para su cultivo hasta que la monocapa celular quede cubierta con el fondo del orificio (placa plana de 96 orificios) y agregue el fármaco con gradiente de concentración. En principio, el medicamento se puede agregar después de que la célula esté adherida a la pared, dos horas o medio día, pero a menudo agregamos el medicamento en la tarde del día anterior y a la mañana siguiente. Generalmente, se establecen de 5 a 7 gradientes, 100 ul por orificio y de 3 a 5 orificios múltiples. Se recomienda establecer 6; de lo contrario, será difícil reflejar la situación real. La siguiente figura se puede utilizar como paso de referencia para una placa de 96 orificios.

L Para la dosificacion, algunas personas agregan medicamentos directamente en placas de 96 pocillos en diferentes volumenes para formar un gradiente de concentracion. Pero creo que deberíamos intentar mezclar diferentes concentraciones de fármacos en el tubo EP, luego retirar el sobrenadante de cultivo de la placa de 96 pocillos (que se puede succionar con una pistola de descarga) y agregar 100 ul de medio de cultivo que contenga diferentes concentraciones de fármacos, lo que puede garantizar la precisión de la concentración del fármaco. Además, cabe señalar que si se utiliza este método, no succione toda la solución de cultivo de la placa de 96 pocillos antes de agregar el medicamento. Debe agregar muestras inmediatamente después de chupar una parte para evitar la muerte celular debido al secado de la placa de 96 pocillos.

Incubar con 4,5% de CO2 a 37 grados durante 16 a 48 horas y observar el efecto del fármaco bajo el microscopio invertido. La siguiente figura muestra un gradiente típico de citotoxicidad de un fármaco.

4. Agregue 10 ul de solución de MTT (5 mg/ml, es decir, . 0.5 % de MTT) a cada pocillo y continúe cultivando durante 4 h. Si el medicamento puede reaccionar conazul de tiazolilola solución de cultivo se puede desechar después de la centrifugación y la solución de cultivo que contiene MTT se puede agregar después de lavarla con PBS 2-3 veces.

5. Detener el cultivo y preparar para la disolución y cristalización.

Azul de tiazolilo, cuyo nombre chino es azul de metilo, es un importante compuesto orgánico ampliamente utilizado en medicina, biología y química. en medicina, a menudo se usa para tratar el envenenamiento por nitritos, el envenenamiento por cianuro, etc., y también se usa en el diagnóstico y tratamiento adyuvante de algunas enfermedades; en la investigación biológica, se puede usar como agente colorante para marcar células o tejidos. Sin embargo, como muchos fármacos, el azul de metileno también puede tener una serie de efectos secundarios durante su uso:

Efectos secundarios del sistema digestivo.

Las náuseas y los vómitos son uno de los efectos secundarios comunes del azul de metileno en el sistema digestivo. Cuando el azul de metileno ingresa al cuerpo, puede estimular la mucosa gastrointestinal, provocando náuseas e incluso vómitos en casos graves. Este síntoma es más pronunciado cuando la velocidad de la inyección intravenosa es demasiado rápida o la dosis es demasiado grande. Por ejemplo, en algunos casos clínicos, los pacientes pueden experimentar náuseas y vómitos importantes poco después de la inyección intravenosa rápida de azul de metileno, lo que afecta su comodidad y experiencia de tratamiento. Algunos pacientes pueden experimentar dolor abdominal después de usar azul de metileno y el grado de dolor puede variar según las diferencias individuales, desde una molestia leve hasta un dolor más intenso.

Al mismo tiempo, también puede ir acompañado de diarrea, que puede deberse a la interferencia del azul de metileno en la peristalsis intestinal y la función digestiva, lo que provoca movimientos intestinales anormales y cambios en la secreción de líquido digestivo. La aparición frecuente o prolongada de dolor abdominal y diarrea no solo afecta la absorción de nutrientes y la salud física del paciente, sino que también puede provocar otras complicaciones.

Efectos secundarios del sistema urinario

Después de usar azul de metileno, el color de la orina se volverá azul, lo cual es causado por la excreción de azul de metileno y sus metabolitos en la orina a través de los riñones. En general, este cambio de color de la orina es temporal y no tendrá un impacto grave en la salud física. Pero en algunos casos especiales, como en pacientes con enfermedades del sistema urinario, los cambios en el color de la orina pueden interferir con el diagnóstico de la enfermedad y los médicos deben realizar un análisis completo basado en otros indicadores del examen. Al orinar, algunos pacientes pueden sentir una sensación de escozor en la abertura uretral.

 

Esto puede deberse al efecto estimulante del azul de metileno sobre la mucosa uretral, especialmente cuando la concentración de orina es alta o se frota la mucosa uretral al orinar, la sensación de escozor será más pronunciada. Este síntoma puede provocar ciertas molestias a los pacientes y afectar a su vida diaria.

Efectos secundarios neurológicos

Los mareos y el dolor de cabeza son efectos secundarios neurológicos comunes del azul de metileno. Después de usar azul de metileno, los pacientes pueden sentirse mareados y desorientados en la cabeza, o experimentar molestias como hinchazón y dolor en la cabeza. Este síntoma puede afectar la atención y la capacidad de pensamiento del paciente y reducir la eficiencia en el trabajo y la vida. La aparición de mareos y dolor de cabeza puede estar relacionada con los efectos del azul de metileno en los vasos sanguíneos y los nervios del cerebro, y el mecanismo específico aún necesita más investigación. En casos raros, el azul de metileno puede provocar trastornos del conocimiento como somnolencia, coma, etc.

Esto suele deberse al uso excesivo de azul de metileno o a que los pacientes son demasiado sensibles al fármaco, lo que provoca una inhibición grave del sistema nervioso central. Los trastornos de la conciencia son un efecto secundario grave que puede poner en peligro la vida del paciente y requieren un tratamiento de rescate inmediato.

1. ¿Cuál es el uso del bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo?

Azul de tiazolilo Azul de tetrazolio (MTT) se puede utilizar para medir la proliferación celular. El MTT produce una solución amarillenta que las deshidrogenasas mitocondriales de las células vivas convierten el MTT formazán azul oscuro-insoluble en agua.

2. ¿Es seguro almacenar el azul de tiazolilo?

Condiciones de temperatura: selle el polvo y guárdelo en el refrigerador a -20 grados para conservarlo congelado, lo que puede extender efectivamente la vida útil (generalmente de 1 a 2 años); para almacenamiento a corto plazo (dentro de 1 mes), se puede conservar temporalmente en condiciones de refrigeración de 4 grados.

Requisitos a prueba de luz-y humedad-: el polvo de MTT es sensible a la luz-y debe almacenarse en botellas de reactivo marrones o botellas transparentes envueltas con papel de aluminio. Mientras tanto, se deben agregar agentes secantes (por ejemplo, gel de sílice) para evitar que el polvo absorba humedad y se apelmace.

3. ¿Cambiará el color del azul tiazolilo?

Cuando la solución muestra un precipitado azul violeta o se oscurece, indica que se ha oxidado y no se puede seguir utilizando.
Evite colocar la solución a temperatura ambiente o en un ambiente luminoso, ya que puede fallar rápidamente.

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