Aprotinina CAS 9087-70-1

aprotinina78R2S7, fórmula molecular C284H432N84O, CAS 9087-70-1, es un inhibidor de proteasa que puede inhibir la tripsina y la quimotripsina, prevenir la activación de otros proteosomas activos en el páncreas y la autoactivación del tripsinógeno. Utilizado clínicamente para la prevención y el tratamiento de pancreatitis aguda, hemorragia causada por fibrinólisis y coagulación intravascular diseminada. También se puede utilizar para tratamientos antichoque. Los inhibidores de proteasa son sustancias que pueden unirse a enzimas y reducir la tasa de degradación del sustrato. Los inhibidores de proteasa con propiedades proteicas están ampliamente presentes y se han aislado dos tipos de inhibidores de proteasa con propiedades proteicas de la soja: el inhibidor de tripsina de Kuniz y el inhibidor de Baumann Bellck. El primero tiene un peso molecular de 20-25 ku, mientras que el segundo tiene un peso molecular de 8 ku.

recombinanteaprotinina(RTI16) puede inhibir la quininasa y la tripsina, y es un inhibidor natural de la serina proteasa no-específico. Es una proteína básica de cadena sencilla compuesta por 58 residuos de aminoácidos, con 3 enlaces disulfuro entrecruzados-en la cadena. Durante mucho tiempo, el aprotinn se ha utilizado para el tratamiento de la pancreatitis aguda. Después de la década de 1990, la aprotina recombinante comenzó a utilizarse en cirugía cardiotorácica para proteger las plaquetas, reducir el sangrado y la exudación y para el tratamiento clínico de pacientes con trastornos de la coagulación. Por lo tanto, el tamaño del mercado de aprotinn se ha expandido rápidamente y se ha convertido en uno de los fármacos bioquímicos importantes.

Síntesis

 

En la actualidad, las preparaciones de aprotina recombinante disponibles comercialmente son principalmente extractos de órganos como el pulmón bovino, que tienen procesos complejos y altos costos. Por lo tanto, es de gran importancia explorar la producción de aprotina recombinante utilizando métodos de ingeniería genética.

Cuando se utiliza un sistema de expresión de secreción, la producción de aprotina es generalmente baja y la actividad del producto resultante también es baja. A través de la expresión de fusión, se espera aumentar en gran medida el nivel de expresión de aprotina recombinante.

 

Para este fin se construyó un plásmido de expresión de aprotina recombinante pGrxA BPTI y se diseñó un sitio de reconocimiento para FXa entre el compañero de fusión y la aprotina recombinante. Después de expresarse en forma de cuerpo de inclusión, el compañero de fusión se purificó y se volvió a plegar mediante filtración en gel. FXa escindió el compañero de fusión para obtener una proteína con la misma actividad que el producto natural. Mediante la optimización de las condiciones de expresión, el rendimiento mejoró significativamente en comparación con los sistemas de expresión anteriores.

Optimización de la expresión de bacterias de ingeniería:

 

Inocular bacterias de tubo de glicerol en placas de agar LB/AMP, cultivar a 37 grados durante 20 horas, raspar las colonias e inocularlas en 5 ml de medio líquido LB/AMP a 37 grados, 200 r/min y cultivar durante la noche. Inocular el 5% del inóculo en 100 ml de medio de suspensión de maíz, cultivar a 37 grados y 220 r/min en un agitador, inducir durante 7 horas y luego centrifugar (8000 r/min, 5 min, 4 grados) para recoger las células bacterianas. Pesar el peso húmedo de las células bacterianas y detectar su expresión mediante SDS-PAGE al 15%.

Cultivo en tanques de fermentación.

 

Cultivo en tanques de fermentación:

Utilizando un tanque de fermentación German Biostat de 30 L, a 37 grados, con oxígeno disuelto controlado al 20%, pH 7,0. Utilizando un tanque de fermentación para expresar la proteína de fusión, se obtuvieron 260 g de células bacterianas húmedas a partir de 16 L de caldo de fermentación, aproximadamente 16 g/L; El nivel de expresión es de aproximadamente 45%,

Rotura de pared y adquisición de cuerpos de inclusión de células bacterianas:

 

Una vez completado el cultivo, recoger las células bacterianas, añadir 1 g de células bacterianas a 10 ml de solución A (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), suspenderlas completamente, sonicar las células en un baño de hielo, trabajar durante 30 segundos, intervalo de 10 segundos, potencia 400 W, 30 ciclos. Transfiera el líquido a un tubo de centrífuga, centrifugue a 4 grados y 8000 r/min durante 15 minutos y el precipitado es el cuerpo de inclusión crudo.

Preparación de la solución de disolución de cuerpos de inclusión:

 

Lave el cuerpo de inclusión crudo con solución B (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) dos veces, cada vez durante 0,5 horas, centrifugue para eliminar el sobrenadante y obtenga cuerpos de inclusión relativamente puros. Añadir 1 g de cuerpos de inclusión a 5 ml de solución C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L urea, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), incubar durante la noche a 4 grados, desnaturalizar y disolver, centrifugar a 12000 r/min durante 15 minutos y recoger el sobrenadante para obtener la solución de disolución del cuerpo de inclusión. Obtener aprotina recombinante.

Efectos farmacológicos:

 

 

aprotininaInhibe la tripsina humana, la enzima fibrinolítica, la angiotensina plasmática y tisular a través de complejos inhibidores de enzimas reversibles formados en una determinada proporción química. Las proteasas con actividad serina desempeñan un papel importante en el sistema de cininógeno vasopresina, el sistema del complemento y el sistema de coagulación, donde la plasmina y la vasopresina plasmática desempeñan funciones críticas.

 

Aprotinn ejerce su efecto inhibidor formando un complejo de proteasa aprotinn a través de la porción activa de serina en la enzima. Sin embargo, cuando se combina con diferentes proteasas, presenta diferentes constantes de disociación. La unión con tripsina es la más fuerte (Ki=0.06nmoN), que es una de las constantes más bajas reportadas en las interacciones proteína-proteína (Laydunski et al. 1974). La unión con la enzima fibrinolítica humana no es muy fuerte. Debido al alto valor de K del complejo inhibidor de la enzima (Ki=1 nmoN), puede ser reversible (Wimann, 1980), y el complejo que se une a la angiotensina plasmática humana es bastante débil (Ki=30 nmol/l), pero aún está dentro del rango terapéutico de aprotinn (Nakahara, 1983).

 

Aprotinn no sólo se une a moléculas de enzimas libres, sino también a enzimas que ya se han unido a un tercer componente (si el centro activo de la enzima todavía tiene capacidad de unión). Por lo tanto, la aprotina inhibe las enzimas fibrinolíticas libres y también puede inhibir el complejo intermedio de la cadena de fibrinolisina quinasa formado durante la terapia trombolítica con la cadena de quinasa (Wimann, 1980).
El efecto antifibrinolítico del aprotinno se basa en la inhibición de la plasmina activada por la hidrólisis de proteínas. A diferencia de los disolventes antifibrinolíticos sintéticos, debido a su inhibición directa de la plasmina sobreactivada, la aprotina no solo protege el sustrato directo (fibrina) de la degradación por la plasmina, sino que también protege el fibrinógeno, los factores V y VIII en plasma y la alfa 2-globulina en suero.

 

En los experimentos de shock inducido por endotoxinas y shock hipovolémico, Trasylol puede inhibir significativamente la activación del cininógeno. (Massion et al., 1972).
Trasylol puede prevenir o retrasar el desarrollo de edema intersticial pulmonar (pulmón en shock). Su efecto inhibidor depende de la dosis-y del tiempo-(Lorthioir et al., 1973).
Durante el shock, el páncreas isquémico puede producir una sustancia peptídica altamente tóxica, a saber, el factor inhibidor del miocardio (MDF). Este factor está estrechamente relacionado con la muerte por shock.

 

El MDF se puede detectar en el plasma de ratones, perros, monos y humanos con shock hemorrágico, séptico, cardiogénico y por quemaduras. El MDF puede provocar una disminución de la contractilidad miocárdica en todos los casos de sangrado y, al mismo tiempo, provoca la contracción de los vasos de resistencia viscerales, provocando isquemia local y producción de más MDF. Además, debido al daño tóxico causado al sistema reticuloendotelial, se retrasa su eliminación en el torrente sanguíneo. Trasylol puede prevenir en gran medida la producción de MDF (Lefer 1984).

aprotinina, como compuesto de molécula pequeña que resiste la fibrinólisis, exhibe propiedades inhibidoras de enzimas significativas y específicas. No sólo inhibe eficazmente la actividad de la tripsina, sino que también actúa ampliamente sobre otras enzimas proteolíticas relacionadas, desempeñando así un papel importante en los experimentos de biología celular. Especialmente durante la lisis y homogeneización de células y tejidos, Aprotinn puede servir como un inhibidor de proteasa eficaz, previniendo eficazmente la degradación accidental de las proteínas objetivo, lo cual es crucial para mantener la integridad y precisión de la muestra.

El efecto inhibidor de Aprotinn muestra una clara dependencia de la dosis, es decir, a medida que aumenta su concentración, también aumenta en consecuencia el efecto inhibidor sobre la actividad fibrinolítica. Esta característica permite a los investigadores controlar con mayor precisión las condiciones experimentales para obtener resultados experimentales más confiables y reproducibles. Mientras tanto, Aprotinn también puede prolongar el tiempo de coagulación de la sangre, lo que confirma aún más su importante papel en el mecanismo de coagulación. Los experimentos in vitro han demostrado que Aprotinn es un inhibidor eficaz de la vía de coagulación endógena que puede interferir y regular procesos clave en el proceso de coagulación.

Aprotini también ha demostrado sus efectos farmacológicos únicos. Puede inhibir significativamente el proceso de disolución de coágulos sanguíneos in vitro, prolongar el tiempo de sangrado del corte de cola en ratas y prolongar el tiempo de coagulación en plasma humano. Estos hallazgos sugieren que Aprotinn puede tener posibles efectos antihemorrágicos y antitrombóticos. Para validar aún más su efecto in vivo, los investigadores realizaron experimentos en un modelo de cortocircuito arteriovenoso en rata. Los resultados mostraron que Aprotnin puede reducir significativamente el peso de los coágulos sanguíneos, lo que respalda aún más su potencial como fármaco antitrombótico.

En resumen, Aprotnin, como compuesto de molécula pequeña que inhibe la fibrinólisis, ha demostrado importantes propiedades inhibidoras de enzimas y efectos farmacológicos tanto in vitro como in vivo. Su aplicación en experimentos de biología celular proporciona a los investigadores herramientas poderosas, mientras que sus hallazgos en estudios in vivo proporcionan pistas y bases importantes para su desarrollo como fármaco antihemorrágico y antitrombótico. En el futuro, con más investigaciones sobre el mecanismo de acción de Aprotnin y ensayos clínicos, se espera que veamos su aplicación más amplia en el campo médico.

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